中大新聞網(wǎng)訊（通訊員李佳璇）擴增子捕獲 (Amplicon capture) 是一種經(jīng)濟高效的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù)收集方法。該方法首先利用通用擴增引物集從目標(biāo)生物類群的代表物種中擴增大量的目標(biāo)PCR片段 (即擴增子)；然后在這些片段的兩端添加生物素化的接頭，并用生物素標(biāo)記的接頭引物對片段進行擴增，得到大量含有生物素標(biāo)記的擴增子探針；接著就可以利用這些探針從DNA文庫中“釣”取特定區(qū)域并進行高通量測序 (圖1)。在擴增子捕獲實驗中，擴增子探針的數(shù)量和組成可以根據(jù)項目需求靈活調(diào)整，制備周期短，實驗成本低，捕獲得到的數(shù)據(jù)完整，因此該方法廣泛適用于從種級至綱級的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究。
圖1. 擴增子捕獲用于系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究的一般工作流程
開展擴增子捕獲實驗的關(guān)鍵在于擁用大量類群通用的擴增引物集，但目前這些通用的擴增引物資源卻相當(dāng)有限，僅在脊椎動物、甲蟲和鱗翅目昆蟲中有少量的積累，這極大限制了擴增子捕獲的廣泛應(yīng)用。目前國際數(shù)據(jù)庫中動物的基因組數(shù)據(jù)正在快速積累，覆蓋了大多數(shù)后生動物類群，這為通用擴增引物的開發(fā)提供了重要的數(shù)據(jù)來源。然而，大規(guī)模分析大量物種的基因組數(shù)據(jù)并進行引物開發(fā)需要豐富的基因組數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗和引物設(shè)計經(jīng)驗，對絕大多數(shù)研究者而言是一項巨大的挑戰(zhàn)。針對這一問題，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張鵬團隊開發(fā)了一款名為UPrimer的通用擴增引物設(shè)計程序。它能夠以基因組數(shù)據(jù)為輸入，全自動化的為給定生物類群大規(guī)模開發(fā)通用擴增引物集，助力擴增子捕獲實驗在相關(guān)生物類群中開展。
UPrimer采用Python語言編寫，包含兩大模塊，涵蓋了通用擴增引物開發(fā)的全部過程。與其他的通用引物設(shè)計程序相比，UPrimer有兩個獨創(chuàng)之處：一是具備全自動化的引物開發(fā)模式。研究者僅需要輸入一行簡單的命令，UPrimer就能自行分析基因組數(shù)據(jù)并輸出目標(biāo)生物類群的通用擴增引物表。該表可直接用于引物合成以及后續(xù)的擴增子捕獲實驗。二是引物設(shè)計采用巢式PCR引物設(shè)計策略，即設(shè)計兩對引物擴增目標(biāo)區(qū)域。該策略能夠大大增加基因片段的擴增成功率 (>90%)，顯著提升擴增子探針制備的效率。
借助UPrimer，研究人員為21個后生動物類群開發(fā)了擴增通用引物集，覆蓋了節(jié)肢動物、軟體動物、刺胞動物、扁形動物、棘皮動物以及脊椎動物等主要多細胞動物分類單元，每套引物集包含約1,000個基因片段。為了驗證UPrimer開發(fā)引物的擴增性能，研究團隊選取了六個后生動物代表類群進行PCR擴增測試。結(jié)果表明，無論在亞目、目、綱還是亞門級的分類水平，UPrimer設(shè)計的通用引物集均能高特異性的擴增出目標(biāo)基因片段，擴增成功率均超過90% (圖2)，這表明UPrimer開發(fā)的引物集非常易于使用，完全能滿足擴增子捕獲探針制備的要求。
圖2. 六個后生動物類群(十足目、腹足綱、脊椎動物亞門、蜘蛛目、異翅亞目、鱗翅目)引物集的PCR擴增試驗結(jié)果
擴增子捕獲與近年來廣泛采用的基于商業(yè)合成探針的AHE、UCE捕獲測序相比，在探針制備成本、探針制備周期、捕獲片段的平均長度上均有明顯優(yōu)勢（表1）。Uprimer引物自動化開發(fā)功能的實現(xiàn)，讓非生物信息學(xué)專家也能輕松地通過基因組分析獲取所需的通用引物集，進而借助擴增子捕獲以低成本、快速、便捷的方式獲取基因組級別的分子數(shù)據(jù)。隨著更多類群通用性引物集被開發(fā)出來，擴增子捕獲在未來的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究中將具有廣泛的應(yīng)用前景。
表1. 擴增子探針與商業(yè)合成AHE、UCE探針的比較
（以分析100個鱗翅目物種，收集200 Kb的數(shù)據(jù)為例）
近日，該成果以“UPrimer: A Clade-Specific Primer Design Program Based on Nested PCR Strategy and Its Applications in Amplicon Capture Phylogenomics”為題發(fā)表在國際進化生物學(xué)的權(quán)威期刊Molecular Biology and Evolution上。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張鵬教授和梁丹副教授為該項工作的共同通訊作者，原博士后李佳璇 (現(xiàn)于暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院工作) 為該文第一作者。此項研究得到了國家自然科學(xué)基金等項目資助。
論文鏈接：https://academic.oup.com/mbe/article/40/11/msad230/7313555
